数字PCR-精准医疗中的新技术浪潮

医疗组高级投资经理 王磊

 

数字PCR（dPCR）是精准医疗中的新技术浪潮。它的与众不同之处在于通过微流体芯片、通道或液滴实现分液，而每个都作为单独的PCR反应，带来了出色的灵敏度。同时，也无需建立标准曲线。数字PCR因其精确性、重复性以及在诊断和制药应用上的潜力而引起了行业的极大关注。随着新应用的不断开发，数字PCR正展示出迷人的魅力。

从1985年PCR作为生物专利技术首次亮相以来，已历经第二代荧光定量PCR（qPCR）到第三代数字PCR（dPCR）的更新迭代。数字PCR是一种新开发的，基于荧光定量PCR技术的核酸分子绝对定量技术，和传统荧光定量PCR相比，具有更高的灵敏度和准确性，被行业认为是支持液体活检的最有潜力的技术之一。2016年Markets and Markets发布报告指出，去年全球dPCR和qPCR市场规模为32.8亿美元，2021 年预计达到49.4亿美元，除了北美和欧洲占据主要市场份额，中国、日本、印度等亚太地区的市场增速最快。

实时定量PCR（qPCR）技术是基因检测的最主要技术，它是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，是一种相对定量技术，核酸拷贝数的精确定量一直是困扰人们的难题。在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微时，其检测灵敏度、精确度都受到了限制。

数字PCR即digital PCR（dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。数字PCR与传统定量 PCR（qPCR）技术不同，数字 PCR 采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数，检测极限可达单拷贝，具有比传统 qPCR 更加出色的灵敏度、特异性和精确性。

ddPCR工作原理

ddPCR（droplet digital PCR）是基于微液滴平台的数字PCR技术，拥有比其他数字PCR技术更高的分辨率和检测灵敏度。

首先通过微液滴生成仪将含待测样品均分到大量直径为微米级的“油包水”微液滴中，体积为皮升级，数量为十万到百万级。由于微液滴数量足够多，微液滴之间被油层相互隔离，因此每个微液滴相当于一个“微型PCR孔”，微液滴中只含有待测样品的单分子DNA；针对这些单分子DNA在每个微液滴中进行PCR扩增反应，完成荧光标记和信号放大。通过微液滴分析仪对每个微液滴荧光信号进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，意味着有一个初始DNA分子，没有荧光信号的微滴判读为0，意味着没有初始DNA分子。根据泊松分布原理实现对核酸样本的绝对定量。

数字PCR的应用前景

无创产前检测（NIPT）孕育了百亿市场，肿瘤个体化治疗领域市场规模超百亿元，易感人群的肿瘤基因检测（预防领域）市场潜力更大，将达到千亿规模，而分子靶向治疗是发展最快的细分领域。这些应用都可以用数字PCR实现。除此之外，数字PCR还可以用于甲基化含量鉴定、二代测序辅助建库、CRISPR-Cas9基因编辑结果验证、微生物（病毒、细菌等）的检测等多个领域。

数字PCR在NIPT领域的应用

随着二胎政策放开，出现了更多的高龄孕妇。如何精确、简便、快速地对孕妇，尤其是高龄孕妇进行产前检测，是每个家庭都关心的大事。我国新生儿出生缺陷率为5.6%，如何控制出生缺陷，是摆在我国相关政府部门的一道难题。

血清学筛查和超声等产前检测方法虽然已经普及，但灵敏度和准确性欠佳。羊水穿刺是传统产前诊断技术，但孕妇不乐意接受，原因是对胎儿和孕妇都有相当程度的危险。

安全、准确的无创产前检测技术（non-invasive prenatal testing，NIPT）是利国利民的大事。NIPT是建立在孕妇外周血中存在着胎儿游离DNA这一科学发现上的，其核心是针对孕妇外周血中的痕量胎儿游离DNA进行扩增以及精确定量分析。

目前NIPT主要采用的技术路线为高通量全基因组测序。数字PCR技术具有成本低、自动化程度高、操作简单、出报告快等优点，将进一步有力推动NIPT的普筛。

数字PCR在肿瘤领域的应用

肿瘤是全球重大疾病。如何更早的发现肿瘤、更有针对性的治疗，是有效控制肿瘤和提高生存率的两大难题。

组织活检在肿瘤的诊治中扮演重要作用，但存在许多局限性：第一，并非所有的肿瘤病人都能通过手术获得病灶；第二，组织活检给患者带来很大痛苦，也不能频繁取样，依从性差；第三，肿瘤组织存在异质性，即病灶的不同部位存在差异，不能准确反映肿瘤情况。

新兴的肿瘤液体活检，即采用循环肿瘤DNA（ctDNA）为检测对象能很好的解决上述难点。ctDNA采用外周血采样，是无创或微创的，可以提高肿瘤病人依从性并多次采样；ctDNA能准确反映肿瘤的整体情况，克服异质性。

ctDNA是凋亡的肿瘤细胞上脱落的基因片断，是传递肿瘤信息的密码，是优秀的肿瘤标志物，可用于肿瘤发展、治疗和预后评价。

ctDNA的检测研究集中于数字PCR和超高通量测序两大技术平台，其中数字PCR具有更高的灵敏度和更低的成本，在肿瘤液体活检和临床应用中将扮演领导地位。

投资机会

在测序领域，测序仪器平台被外资Illumina和LIFE两家企业占据了几乎全部市场份额。国内企业在测序仪器平台的核心技术积累过于薄弱，难有企业能够挑战外资厂商的地位，只能在这两家外资厂商的仪器平台上开发临床应用,在发展上受到外资仪器厂商的制约，很过公司沦为纯粹的测序工厂。

数字PCR领域，国内企业经过多年的研发，已有产品即将陆续面世，例如杭州领航基因、上海臻准科技、上海小海龟科技、广州永诺生物、深圳博瑞生物、北京卡尤迪生物，苏州锐讯生物等公司纷纷在2018年推出产品样机，有些厂商公开的仪器性能指标已经超越了外资BioRaid和Life。在众多厂商中，真正突波了油包水液滴技术以及芯片技术的公司，并有能力进行试剂研发，实现仪器试剂一体化应用开发的公司将脱颖而出。

在这个时间点上，围绕数字PCR提前进行产业布局，把握精准医疗细分市场上中国制造的重要机会，是我们努力的方向。